外源基因的細(xì)胞株初始培養(yǎng)

293細(xì)胞比較容易轉(zhuǎn)染，是一個(gè)很常用的表達(dá)研究外源基因的細(xì)胞株。液氮罐

293細(xì)胞的一個(gè)衍生株：293T/17的轉(zhuǎn)染效率更高，成為廣大研究者研究基因功能的一個(gè)強(qiáng)大工具。293細(xì)胞的缺陷是生長(zhǎng)過(guò)程中貼壁強(qiáng)度比較小。所以在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中容易流失，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如果一個(gè)實(shí)驗(yàn)室新得到的293細(xì)胞是郵寄得到的并且細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中，就需要讓細(xì)胞沉降幾天時(shí)間，因?yàn)榇罅考?xì)胞會(huì)漂浮在培養(yǎng)液里。

293細(xì)胞系是原代人胚腎細(xì)胞轉(zhuǎn)染5型腺病毒(Ad 5) DNA的永生化細(xì)胞，表達(dá)轉(zhuǎn)染的腺病毒5的基因。

來(lái)源：人體腎臟 形態(tài)：上皮細(xì)胞 生長(zhǎng)特性：貼壁 注釋：該細(xì)胞含腺病毒5 DNA 。

培養(yǎng)液： MEM( 含 2 mM L-谷氨酰胺 和 Earle's BSS，1.5 g/L NaHCO3, 0.1 mM 非必需氨基酸, 1.0 mM 丙酮酸鈉)， 10% 馬血清(熱滅活)。

傳代： 吸去培養(yǎng)液。 用0.25% (w/) Trypsin- 0.53 mM EDTA洗一次，以去除血清(血清會(huì)抑制胰酶的活性)。 加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)約5分鐘，直到細(xì)胞全部脫落。 加6-8毫升培養(yǎng)液，用移液器把細(xì)胞吹散。 加適量的細(xì)胞到新的培養(yǎng)器皿中。(以1：2到1：4為宜，傳代期間培養(yǎng)液2-3天更換1次)

凍存：95%培養(yǎng)液+5%DMSO凍存于液氮。

293A 比較有意思了，是293中后來(lái)又建的細(xì)胞亞株，這個(gè)A是adhere的意思，就是說(shuō)293傾向于形成單層細(xì)胞(monolayer)，它比293好的地方是在做計(jì)算病毒數(shù)量的空斑試驗(yàn)(plaque assay)293A是均勻的一層，沒(méi)有細(xì)胞重疊和細(xì)胞空隙(hole)，就這個(gè)意思，這個(gè)A所對(duì)的是293S(suspension).液氮罐

293T細(xì)胞表達(dá) E1A蛋白，S40大T抗原，含有S40復(fù)制起始點(diǎn)與啟動(dòng)子區(qū)的質(zhì)粒可以復(fù)制。

293FT細(xì)胞能制造高滴度的慢病毒。293A細(xì)胞來(lái)源于人腎纖維母細(xì)胞，組成性表達(dá) E1A 和 E1B 蛋白。

QBI-293A細(xì)胞培養(yǎng)

293A 細(xì)胞來(lái)源于一個(gè)用作空斑測(cè)定的亞克隆，具有易使用和易轉(zhuǎn)染的特性。該細(xì)胞株對(duì)于高細(xì)胞密度很敏感，當(dāng)細(xì)胞超過(guò)70%匯合時(shí)，一些細(xì)胞可能會(huì)丟失它們的表型。若細(xì)胞密度持續(xù)在70%以下，QBI-293A細(xì)胞則能連續(xù)培養(yǎng)3~4個(gè)月維持原有細(xì)胞特性。若以購(gòu)買得到的293作為**代，則30代內(nèi)能得到**結(jié)果。一旦到了30代，**復(fù)蘇一管細(xì)胞開(kāi)始新的培養(yǎng)。所以，我們建議你在收到細(xì)胞后應(yīng)盡快建立自己的QBI-293A細(xì)胞庫(kù)。

    5.1.1 QBI-293A細(xì)胞初始培養(yǎng)

1. 將凍存的一管QBI-293A細(xì)胞在37℃水浴輕輕晃動(dòng)融化。

2. 融化后在超凈臺(tái)無(wú)菌條件下用70%乙醇將凍存管的蓋沿擦拭干凈。

3. 將細(xì)胞轉(zhuǎn)入15mL無(wú)菌離心管中，加入10mL DMEM 10%，600×g離心5分鐘使細(xì)胞沉淀。

4. 棄去上清。

5. 將細(xì)胞用10mL DMEM 10%重懸，輕輕打勻

6. 轉(zhuǎn)入75cm2培養(yǎng)瓶或100mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。液氮罐

7. 在5% CO2孵箱中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

8. 第二天觀察細(xì)胞匯合率，若合適則可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，否則按5.1.2所述繼續(xù)培養(yǎng)。

5.1.2 QBI-293A細(xì)胞的維持培養(yǎng)和增殖

QBI-293A細(xì)胞必須按1:10到1:20傳代

1. 室溫下胰酶消化1~3分鐘使貼壁細(xì)胞脫落

2. 拍打培養(yǎng)瓶邊緣使細(xì)胞脫落，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓，是否已從培養(yǎng)瓶表面脫落。

3. 按需要用新鮮培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶中。在5% FBS中，細(xì)胞倍增的時(shí)間是26小時(shí)，在10% FBS中稍短一些。

5.1.3 QBI-293A細(xì)胞的凍存

建立細(xì)胞庫(kù)時(shí)必須使培養(yǎng)的細(xì)胞匯合率低于50%，以保證亞克隆的特定表型。

1. QBI-293A細(xì)胞必須在含10%高質(zhì)量FBS的DMEM中培養(yǎng)。

2. 將健康生長(zhǎng)的QBI-293A細(xì)胞離心沉淀。

3. 以*小體積的DMEM 10%重懸細(xì)胞。

4. 用血球計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

5. 用DMEM5% + 10% DMSO + 40% FBS重懸細(xì)胞，細(xì)胞終濃度為1×106/mL。

6. 無(wú)菌操作將1mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入2mL凍存管中。

7. 將凍存管放入凍存盒中，-80℃儲(chǔ)存24小時(shí)。這一簡(jiǎn)便措施可保持約1℃/分鐘的降溫速率，適于凍存細(xì)胞。

8. 第二天將凍存的細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮罐或-150℃冰箱中長(zhǎng)期保存。QBI-293A細(xì)胞若正確凍存，則可在液氮罐中保存數(shù)年。液氮罐