用液氮冷凍真空保存犢牛睪丸原質細胞

犢牛睪丸細胞作為多種病毒增殖的基質，已經應用在疫苗生產中，并有廣泛的開發前景，但是由于產犢季節的不均衡，給生產帶來了困難，為了使生產不受季節影響，同時為了避免由保存原代細胞量大、細胞復活率低的問題，做了用液氮冷凍保存犢牛睪丸原質細胞的試驗。

1 材料與方法

1.1犢牛睪丸 出生三天內的，未食初乳的本地黑白花公奶牛。

1.2細胞冷凍液的配制

冷凍液Ⅰ號：按本實驗室設計的方法配制，配方略。

冷凍液Ⅱ號：按常規方法配制，即含20%特牛血清，含5%～10%二甲基亞礬的營養液。

1.3待凍存細胞的制備

1.3.1原質細胞的制備：將犢牛睪丸細胞經一定方法處理后，即在原質細胞自己接加入細胞凍存液中待凍，一般一對牛犢睪丸制備的原質細胞可分裝于3～5個安瓶中。

1.3.2原代細胞的制備：按常規方法消化犢牛睪丸，制得細胞懸液，放置37℃溫室培養，3～4天形成致密單層后，按常規法消化、洗滌、離心，收集細胞泥，分別加入適量的細胞冷凍液，待凍。

1.3.3次代細胞的制備：將原代細胞按常規方法消化、培養，得次代細胞單層，再按上述方法收集細胞泥，加入適量細胞冷凍液，待凍。

2 細胞的冷凍

將上述加入細胞冷凍液Ⅰ號或Ⅱ號液的原質細胞、原代細胞、次原代細胞的細胞瓶，放置4℃、30分鐘，再移到-50℃～-70℃冰箱中預冷2小時，然后迅速移到液氮罐中。

3 細胞復蘇

將安瓶自液氮罐中取出，立即放入38-40℃溫水中，使細胞在1分鐘內融化，無菌吸出細胞懸液，加入新的生長液，將細胞稀釋成50萬個細胞/ml，37℃培養4小時，細胞貼壁后換液一次，繼續增減形成單層細胞。

4 結果與討論

實驗結果如下：

備注：

1 每批凍存細胞凍前都有正常細胞培養對照，以確定細胞消化成功與否。

2 凍存細胞復活率是指復蘇后細胞數/凍前活細胞數比值。

3 細胞生長情況批復蘇后37℃培養4天時細胞生長的致密情況。

4 復蘇后的細胞接毒培養后，均能有效帶毒，同正常培養細胞無差別。

從上表可以看出：

1 用凍存方法保存牛睪丸原質細胞，方法是可行的，這給應用牛睪丸細胞增值病毒的生產和試驗帶來了極大的方便，有利于適當安排生產，同時給器官細胞的保存提供了可靠的依據。

2 從上表可見應用本實驗室配制的細胞凍存液凍存的細胞，復蘇后的存活率要比正常的細胞凍存液要高。

3 從上表可以看出，原代、次代細胞經凍存后，復蘇的存活率為零，具體原因有待于今后進一步探討。